Diagnóstico molecular del virus influenza A (H1N1) 2009 y otros vírus respiratorios, durante la primera ola pandémica en Cuba / Molecular diagnosis of influenza A (H1N1) 2009 virus and other respiratory viruses during the first pandemic wave in Cuba

Introducción: el primer virus pandémico del siglo XXI, el virus influenza A (H1N1)/2009, emergió en México, a finales del mes de abril de 2009, después de un triple reordenamiento entre virus de influenza de origen aviar, humano y porcino, y desde allí se diseminó por el mundo. Frente a ese evento, en Cuba, se adoptaron medidas determinantes antipandémicas, entre ellas, se reforzó la vigilancia virológica con todas las acciones necesarias. Objetivos: detectar y confirmar la entrada del agente causal de la pandemia en el país, de forma rápida, oportuna y además, definir la participación de otros virus en la etiología de las infecciones respiratorias agudas. Métodos: como consecuencia de la vigilancia de laboratorio, entre las semanas epidemiológicas 38 a la 42 de 2009 (meses de septiembre y octubre) se procesó un total de 1 063 muestras clínicas respiratorias (exudado nasofaríngeo, aspirado bronquial y muestras de necropsia de pulmón), detectándose el mayor número de casos confirmados de infección por el nuevo virus en este período, que se correspondió con la primera oleada pandémica en Cuba. El diagnóstico virológico se realizó utilizando un algoritmo de diagnóstico molecular. Resultados: de las 1 063 muestras, 597 (56,0 por ciento) resultaron positivas. El virus de influenza pandémica A(H1N1)2009, fue el agente etiológico detectado con mayor frecuencia en 306 casos sospechosos (51 por ciento), seguido por el virus influenza A(H3N2) en 228 pacientes(38 por ciento). Otros virus respiratorios se diagnosticaron en 63 muestras clínicas (11 por ciento). El virus pandémico se confirmó en 50 gestantes. Los rinovirus se detectaron con mayor frecuencia en muestras de pacientes con diagnóstico clínico de bronconeumonía y bronquiolitis. Durante el período estudiado se reportó un incremento de la morbilidad, se notificaron 225 825 atenciones médicas por infección respiratoria aguda a mediados del mes de octubre. Conclusión: el algoritmo de diagnóstico molecular empleado para la confirmación de los virus influenza y otros virus respiratorios demostró ser sensible, específico y efectivo para garantizar la vigilancia virológica sistemática en nuestro país durante la fase pandémica.

Introduction: the first pandemic virus of the 21st century - the influenza A (H1N1)/2009 virus-appeared in Mexico in April 2009 after triple reassortment of influenza strains of avian, human and pig origin and from there, it was spread worldwide. With the purpose of facing up to this event, Cuba adopted anti-pandemic measures including the virology surveillance using all necessary actions. Objectives: the detection and validation of the entry of the causative agent of pandemic into the country in a fast and timely way, in addition to the definition of involvement of other viruses in the etiology of acute respiratory infections. Methods: as a result of the lab surveillance, from the 38th to the 42nd epidemiological weeks (September and October, 2009), 1 063 respiratory clinical samples were processed (nasopharyngeal exudates, bronchial aspirates and lung necropsy samples). The highest number of confirmed cases caused by the new virus was detected in this period that represented the first pandemic wave in Cuba. Diagnosis was based on molecular diagnosis algorithm. Results: out of the 1 063 samples, 597 (56.0 percent) were positive. The pandemic influenza A (H1N1) virus was the most commonly detected etiological agent in 306 suspected cases (51 percent) followed by influenza A (H3N2) virus in 228 cases (38 percent). Other respiratory viruses were diagnosed in 63 clinical samples (11 percent). The pandemic virus was confirmed in 50 pregnant women. Rhinoviruses were identified more frequently in those samples from patients with clinical diagnosis of bronchial pneumonia and broncholitis. Morbidity increased during this period; 225 825 medical consultations were notified due to acute respiratory infections mid-October 2009. Conclusions: the molecular diagnosis algorithm proved to be sensitive, specific and effective to assure the systematic virological surveillance in our country during the pandemic phase.

Contribución del Laboratorio Nacional de Influenza al enfrentamiento de la influenza pandémica 2009 en Cuba / Contribution of the National Influenza Laboratory to confront the 2009 pandemic influenza in Cuba

INTRODUCCIÓN: las infecciones respiratorias agudas son consideradas la causa más importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Estas infecciones adquieren mayor significación asociadas a eventos epidémicos y pandémicos ocasionados por los virus influenza. La necesidad de una vigilancia mundial para los virus influenza fue reconocida en 1947 y condujo a la creación de la Red Global de Vigilancia de los virus influenza por la Organización Mundial de la Salud. El Centro Nacional de Influenza de Cuba pertenece a esta red desde 1975. En el mes de abril de 2009 fue reconocido un nuevo virus influenza A (H1N1) de origen porcino que circulaban en humanos, identificado como el agente causal de la primera pandemia del siglo xxi por la Organización Mundial de la Salud. OBJETIVO: llevar a cabo la vigilancia nacional del nuevo virus pandémico. MÉTODOS: el Centro Nacional de Influenza de Cuba desarrolló y organizó un diagrama de diagnóstico para la confirmación en casos sospechosos de infección por este virus. Se emplearon diferentes ensayos de trancripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa para el tipado y subtipado de los virus influenza A. RESULTADOS: entre abril y diciembre de 2009, un total de 6 900 muestras clínicas respiratorias fueron procesadas mediante el diagrama diagnóstico nacional y 980 casos fueron confirmados y notificados a las autoridades nacionales de salud y la Organización Panamericana de la Salud. Los rinovirus humanos resultaron otro de los agentes etiológicos de infecciones respiratorias agudas detectados con frecuencia. CONCLUSIÓN: mediante la estrategia nacional de vigilancia de laboratorio fue posible llevar a cabo un monitoreo efectivo de la circulación de los virus influenza y otros virus respiratorios para alertar a las autoridades nacionales de salud, con vistas a enfrentar la influenza pandémica 2009.

INTRODUCTION: acute respiratory infections are considered the most important causes of morbidity and mortality around the world. These infections became more significant when associated to epidemics and pandemic events caused by influenza virus. The need for global surveillance of influenza viruses was recognized as early as 1947 and led to the establishment of the World Health Organization (WHO) Global Influenza Surveillance Network (GISN). The Cuban National Influenza Centre (NIC) belongs to this network since 1975. On April 2009, the recognition of a new influenza A (H1N1) of swine origin circulating in humans was identified as the causative agent of the first pandemic in the 21st century declared by the WHO. OBJECTIVE: to carry out surveillance of the new pandemic virus nationwide. METHODS: the Cuban National Influenza Center developed a diagnostic diagram to confirm infection with the pandemic virus in suspected cases. Different PCR assays for typing and subtyping of influenza A virus were used. RESULTS: from April to December 2009, 6 900 clinical respiratory samples were processed by using this diagram, 980 cases were confirmed and notified to the national health authorities and to the Pan American Health Organization. Human rhinoviruses were other important etiologic agents of the frequently detected acute respiratory infections. CONCLUSION: with the national strategy for surveillance at lab, it was possible to effectively monitor the circulation of the influenza viruses and of other respiratory viruses in our country and to alert the national health authorities, with a view to facing up to the pandemic influenza (2009).

Diseño y aplicación de un método molecular para el diagnóstico del virus influenza A (H1N1) pandémico en Cuba / Design and implementation of a molecular method for influenza A virus (H1N1) in Cuba

INTRODUCCIÓN: entre marzo y abril de 2009 se produjeron en México brotes de enfermedad respiratoria, debido a un nuevo virus de influenza proveniente del cerdo, el cual se diseminó rápidamente mediante la transmisión humano-humano. Los métodos moleculares usados en la actualidad eran inadecuados, porque la composición del genoma del nuevo virus era muy diferente del virus influenza A (H1N1) que había circulado hasta el momento. En su composición, estaba formado por segmentos de genes de origen aviar, humano y cerdo. OBJETIVO: teniendo en cuenta las secuencias publicadas, se diseñó un juego de cebadores específicos para el gen de la hemaglutinina, con la finalidad de evaluar un nuevo ensayo de TR-RCP para detectar el nuevo virus pandémico en Cuba. MÉTODOS: se procesó un total de 3 197 muestras clínicas de casos sospechosos de infección por el virus influenza A (H1N1) pandémico (pdm) mediante un ensayo de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa. RESULTADOS: el ensayo optimizado permitió obtener una banda de 292 pb, sin reacciones inespecíficas. El nuevo método resultó ser útil en el diagnóstico y subtipado del virus de influenza H1N1 pdm. El producto amplificado fue analizado por secuenciación nucleotídica y se confirmó la identificación del virus. CONCLUSIONES: con la introducción de este nuevo ensayo para la vigilancia de influenza, se fortalece la capacidad diagnóstica del Laboratorio Nacional de Referencia.

INTRODUCTION: from March through April of 2009, Mexico notified outbreaks of respiratory illness, due to a new influenza virus of swine origin, which spread over rapidly via human-to-human transmission. The molecular methods currently in use were not suitable because the genome composition based on gene segments of swine, avian and human origin was quite different from the influenza A virus (H1N1) circulating at that time. OBJECTIVE: based on the published sequences, a set of specific primers for the HA gene was designed to evaluate a new RT-PCR assay. METHODS: the RT-PCR assay processed 3 197 clinical samples from suspected cases of pandemic influenza A (H1N1) infection. RESULTS: the novel optimized method obtained a 262 pb segment, without unspecific reactions. The new method proved to be useful in the diagnosis and subtyping of pandemic HINI influenza virus. The amplified product was verified by nucleotide sequencing, thus confirming the virus. CONCLUSIONS: the introduction of this new assay for the laboratory surveillance of influenza virus strengthens the diagnostic capacity of the National Reference Laboratory.

Estrategia cubana de caracterización molecular del virus influenza A/H1N1pdm / Cuban strategy for the molecular characterization of the pandemic influenza A virus (H1N1)

INTRODUCCIÓN: en Abril de 2009 se identificó una variante del virus influenza A/H1N1 de origen porcino, lo cual determinó que fuese declarada rápidamente la primera pandemia del siglo XXI. OBJETIVO: establecer una estrategia de secuenciación nucleotídica que permitiera diagnosticar diferencialmente los virus influenza A estacionales del nuevo virus pandémico, así como obtener la mayor cantidad de información posible desde el punto de vista molecular de los genes hemaglutinina y neuraminidasa, tanto de pacientes que sufrieron una enfermedad tipo influenza como los que padecieron de una infección respiratoria aguda grave y los que fallecieron. MÉTODOS: se diseñaron e implementaron tres estrategias de secuenciación que brindaron información importante acerca del nuevo virus en Cuba. RESULTADOS: a través de la tercera estrategia se obtuvieron los resultados más completos: diagnóstico diferencial, vigilancia de las mutaciones D222G/E en la hemaglutinina y las variantes virales H275Y resistentes al Tamiflu. A pesar de no haber detectado las mutaciones mencionadas, no se puede descartar su presencia en población cubana, debido a que estas estrategias no fueron diseñadas con ese fin. Se impone diseñar un estudio para cumplir con ese objetivo. CONCLUSIONES: las estrategias de secuenciación aplicadas en nuestro algoritmo permitieron realizar el diagnóstico diferencial de los virus influenza estacional del pandémico y su caracterización molecular.

INTRODUCTION: in April 2009, there was identified a variant of the A/H1N1 influenza virus of swine origin, and shortly after the first pandemic in XXI century was declared. OBJECTIVES: to establish a nucleotide sequencing strategy for the differential diagnosis of the seasonal and pandemic influenza A viruses, and to obtain as much molecular information as possible about hemagglutinin and neuraminidase genes in patients with influenza-like illnesses, in those with severe respiratory infection and in patients who died. METHODS: three sequencing strategies were designed and implemented, which also offered important information about the new virus in Cuba. RESULTS: the third strategy provided the most comprehensive results such as differential diagnosis, the surveillance of the D222G/E mutation in hemagglutinin and Tamiflu-resistant H275Y viral variants. In spite of the fact that the mentioned mutations were not detected, their presence in the Cuban population can not be ignored since these strategies were not designed for this end. It is imperative to design a study to fulfill this objective. CONCLUSIONS: the sequencing strategies in our algorithm allowed the differential diagnosis of the seasonal and the pandemic viruses, and their molecular characterization.

Infección respiratoria aguda grave en pacientes cubanos durante la ola de influenza pandémica A (H1N1) en Cuba, 2009 / Severe acute respiratory infection in Cuban patients during the influenza A (H1N1) pandemic in Cuba, 2009

INTRODUCCIÓN: en abril de 2009 las autoridades de salud de México reportan a la Organización Panamericana de la Salud un incremento de las hospitalizaciones por neumonía con tasas elevadas de mortalidad. El Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, notó que este incremento se presentaba fundamentalmente en las edades de 20 a 40 años. Se identificó un nuevo virus influenza A de origen porcino subtipo (H1N1) como agente causal de la primera pandemia del siglo XXI. El 26 de abril de 2009 el plan nacional de enfrentamiento a la pandemia por influenza (H1N1) es activado por las autoridades nacionales de salud de la República de Cuba y el 7 de mayo se diagnosticó el caso índice de influenza pandémica (H1N1) en Cuba. Se estableció un sistema de vigilancia integrada con confirmación de laboratorio. OBJETIVOS: detectar e identificar el virus de la influenza pandémica durante la ola pandémica. MÉTODOS: durante las semanas epidemiológicas de la 37 a la 41 se observó un alza en el número de atenciones médicas. En este período se seleccionaron para este análisis solo las muestras colectadas de pacientes con diagnóstico clínico de infección respiratoria aguda grave divididas en tres grupos fundamentales, 370 niños y adultos graves, 55 gestantes graves y 30 fallecidos. El diagnóstico fue realizado por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para los virus de influenza pandémica y reacción en cadena de la polimerasa convencional para otros virus respiratorios. RESULTADOS: el virus de la influenza pandémica se detectó en 65, 20 y 9 casos, respectivamente. El virus de la influenza estacional A (H3N2) en 81 casos de infección respiratoria aguda grave, donde se incluyeron pacientes de todas las edades; 10 gestantes graves y en 5 fallecidos, los cuales fueron detectados por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Otros virus respiratorios también fueron monitoreados por reacción en cadena de la polimerasa a punto final. CONCLUSIONES: el análisis integral de estos resultados constituye un aporte a la vigilancia nacional y regional de los virus respiratorios para el perfeccionamiento de los programas de prevención y control de las infecciones respiratorias agudas.

INTRODUCTION: on April 2009, the Mexican health authorities reported increased hospitalization indexes caused by pneumonia with high mortality rates to the Pan-American Health Organization (PAHO). The National Epidemiological Surveillance System of Mexico noticed that this increase mainly occurred in the 20-40 year old population. A new type of swine influenza A (H1N1) virus was identified by laboratory studies as the etiological agent of the first pandemic of the 21st century. On April 26 2009, the National Anti-pandemic Plan was activated by the Cuban Ministry of Public Health, and on May 7th, the lab-confirmed index case appeared. An integrated surveillance system with laboratory confirmation was set up. OBJECTIVES: to detect pandemic influenza virus during the pandemic wave. METHODS: the epidemiological weeks 37 to 41 witnessed a rise of the number of sick people seen by the medical services. In this period, the samples taken from patients clinically diagnosed with severe acute respiratory infection were selected for this analysis; they were divided into three groups, that is, 370 children and adults in critical condition, 55 pregnant women in severe condition and 30 fatal cases. The diagnosis of the pandemic virus was performed by Real Time Polymerase Chain Reaction Test (PCR). Other respiratory viruses were tested by conventional PCR. RESULTS: the pandemic influenza virus was detected in 65 children and adults, 20 pregnant women and 9 fatal cases. The seasonal influenza A (H3N2) virus was identified in 81 cases of severe acute respiratory infection covering all age groups, 10 pregnant women and 5 deceased on the basis of real time polymerase chain reaction test. Other respiratory viruses were also monitored by the end-point polymerase chain reaction. CONCLUSIONS: the comprehensive analysis of these results contributes to the national and regional surveillance of respiratory viruses for the improvement of the prevention and control programs of the acute respiratory infections.

Evaluación de un ultramicroELISA para la detección de la infección por el virus sincitial respiratorio / Evaluation of an ultramicroELISA assay for the detection of infection by the respiratory syncytial virus

Objetivo. El presente trabajo tuvo como objetivo la evaluación de un ensayo de ultramicroELISA (UME) de doble anticuerpo para la detección rápida de anticuerpos IgG al Virus Sincitial Respiratorio (VSR) en monosueros y muestras de sueros pareados. Materiales y métodos. Se evaluaron 1567 muestras de suero por las técnicas de UME y Fijación de Complemento (FC), de ellas 619 eran monosueros de niños menores de 15 años y 474 pares pertenecientes al Programa Nacional de Vigilancia Seroepidemiológica de las Infecciones Respiratorias Agudas. En el UME de doble anticuerpo se utilizó un anticuerpo monoclonal específico a la proteína F del VSR. Resultados. Para los monosueros el UME con respecto a la FC mostró una sensibilidad de 98.9 por ciento, una especificidad de 56.05 por ciento y una coincidencia de 63.9 por ciento. Para los sueros pares la sensibilidad fue de 92.7 porciento, mientras que la especificidad y la coincidencia aumentaron aun 79.3 por ciento y 80.1 por ciento respectivamente. Conclusiones. La utilización del anticuerpo monoclonal permitió la inclusión de preparaciones antigénicas crudas en lugar de fracciones purificadas, disminuyendo notablemente la reactividad obtenida con el control de antígeno. Los resultados obtenidos respaldan la utilización de este método como una herramienta complementaria en estudios seroepidemiológico a gran escala y con fines diagnósticos

Detección y caracterización rápida de los virus de influenza A y B en secreciones nasofaríngeas mediante el método de la inmunoperoxidasa / Fast detection and characterization of the influenza Aand B viruses in nasopharyngeal secretions by the immunoperoxidase method

Con el objetivo de identificar en forma rápida los virus de influenza, se estudiaron 148 muestras de pacientes con sintomatología compatible con esta entidad Para ello fue desarrollado un cultivo rápido de células MDCK-1, en placas de 96 pozuelos, donde fueron inoculados los exudados nasofaríngeos o gargarismos, e incubados durante una noche a 37 grados C, el medio fue eliminado y las células fueron lavadas con buffer fosfato salina; posteriormente fueron fijadas con metanol y los antígenos virales detectados por la técnica de inmunoperoxidasa mediante un pool de anticuerpos monoclonales contra la influenza A y otro contra la influenza B. Para el subtipaje en A (H3N2) y A (H1N1). Del total de muestras positivas (136) correspondió 72,1 porciento para el tipo A y a los subtipos H1 y H3, 34,6 y 37,5 porciento, respectivamente. La influenza B se detectó en 27,9 porciento de las 148 muestras investigadas, sólo 12 resultaron negativas (8,1 porciento). Se recomienda la utilización de esta técnica como un método de diagnóstico rápido, sensible, conveniente y fácil de realizar e interpretar para la detección t caracterización en tipo y subtipo de los virus de influenza a partir de exudados nasofaríngeos o gargarismos

Caracterización de los virus de influenza por el método de la inmunoperoxidasa utilizando anticuerpos monoclonales: Montaje y validación

Se aplicó y validó por primera vez en Cuba el método de inmunoperoxidasa para la clasificación rápida en tipo y subtipo de los virus de influenza. El método está basado en un cultivo rápido en células MDCK-L y el empleo de anticuerpos monoclonales para la clasificación en tipo y subtipo. Se utiliza un pool de anticuerpos contra influenza A y otro contra la influenza B y los anticuerpos monoclonales HA1 - 71 y HA2 - 76 para el subtipaje en H1 y H3. La validación se realizó aplicándolo a 21 cepas de referencia internacional y 23 cepas de virus de influenza humana, aisladas y clasificadas previamente por inhibición de la hemaglutinación. Todas las cepas reaccionaron frente a los anticuerpos monoclonales en correspondencia con su tipo y subtipo de hemaglutinina. Fueron caracterizadas 6 cepas de referencia y 9 aislamientos dentro del subtipo H1N1; 9 cepas de referencia y 10 aislamientos en el subtipo H3N2 y 6 cepas de referencias y 4 aislamientos dentro del tipo B.No hubo reacciones inespecíficas ni cruzadas en los controles establecidos. La sensibilidad, especificidad y coincidencia fue del 100 %. La técnica resultó rápida y conveniente para la caracterización en tipo y subtipo de las cepas de virus de Influenza aisladas. Puede sustituir al método clásico de inhibición de la hemaglutinación cuando se requiere la caracterización rápida de brotes o epidemias de infecciones respiratorias agudas, lo que es de extrema importancia por ser éstas causantes de una alta morbilidad, fundamentalmente en grupos de riesgo, y por su repercusión económica.

The immunoperoxidase method for the rapid classification of influenza viruses in type and subtype was applied and validated for the first time in Cuba. The method is based on a rapid culture in MDCK-L cells and on the use of monoclonal antibodies for the classification in type and subtype. A pool of antibodies against influenza A and another against influenza B and HA1-71 and HA2-76 monoclonal antibodies are used for the subtyping in H1 and H3. The validation was carried out by applying this method to 21 international reference strains and to 23 human influenza virus strains that were isolated and previously classified by hemagglutination inhibition. All the strains reacted to the monoclonal antibodies according to their hemagglutinin type and subtype. 6 reference strains and 9 isolations were characterized within the H1N1 subtype: 9 reference strains and 10 isolations in the H3N2 subtype; and 6 reference strains and 4 isolations in type B. There were neither unspecific nor crossed reactions among the controls established. There was 100 % of sensitivity, specificity and coincidence. The technique used proved to be fast and convenient for the characterization in type and subtype of the isolated influenza virus strains. It may substitute the classic hemagglutination inhibition method when it is required the rapid characterization of outbreaks or epidemics of acute respiratory infections, which is very important due to the high morbidity they cause mainly in risk groups and to their economic repercussion.

Influenzavirus A (H1 N1): algunas características de su hemaglutinina / Influenza A (H1 N1) virus: some characteristic of its hemagglutinins

Con el retorno a la circulación de los virus de la influenza A (H1N1) en 1978 y la activación del mecanismo de fluctuación antigénica de este subtipo, se hizo necesario estudiar las variantes surgidas, con el fin de comparar sus similitudes y diferencias en estructura antigénica. Por ello se caracterizaron las hemaglutininas de 4 cepas: A/Habana/1292/78 (H1N1);A/Brasil/11/78 (H1N1); A/Chile/1/83 (H1N1) y A/Singapore/6/86 /H1N1) por el método de inhibición de la hemaglutinación. Se estudiaron sus espectros de aglutinación con eritrocitos de diferentes orígenes, el crecimiento a diferentes temperaturas y la sensibilidad a los inhibidores de los sueros de animales. Las hemaglutininas fueron también caracterizadas por anticuerpos monoclonales. Se comprobó que las cepas utilizadas guardan relación antigénica entre sí de una forma u otra